萤火虫百科

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有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(七)

2012-09-09 20:17:27 本文行家:岛城小神仙

有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(七)pRL-Null载体pRL-null无真核启动子和增强子序列,在Rluc上游有一些单一酶切位点,可提供最大灵活性来克隆所需的启动子序列,启动海洋腔肠荧光素酶的表达。图9所显示的pRL-TK载体代表了pRL载体所共有的特点,在每个pRL载体的指定启动子的紧下游是一个嵌合的内含子,可提供海洋腔肠荧光素酶的增强表达。内含子由人β-珠蛋白质内含子1的5′-供体剪切位

有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(七)有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(七)

 pRL-Null

载体 pRL-null无真核启动子和增强子序列,在Rluc上游有一些单一酶切位点,可提供最大灵活性来克隆所需的启动子序列,启动海洋腔肠荧光素酶的表达。
    图9所显示的pRL-TK载体代表了pRL载体所共有的特点,在每个pRL载体的指定启动子的紧下游是一个嵌合的内含子,可提供海洋腔肠荧光素酶的增强表达。内含子由人β-珠蛋白质内含子1的5′-供体剪切位点和免疫球蛋白基因重链可变区域的分枝点和3′-受体剪切位点组成(12)。供体和受体剪切位点、分枝点的序列均作了改变以匹配最适剪切位点的共有序列(3)。在Rluc的紧上游是T7 启动子序列,可在体外合成海洋腔肠荧光素酶的转录物。Rluc的下游是SV40晚期poly (A)序列, 提供有效的转录终止和mRNA多腺苷酸化(14)。载体含有原核的复制起始区和β-内酰胺酶基因,可在大肠杆菌中选择质粒的扩增。

 用Passive Lysis Buffer 制备细胞裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶的稳定性。用pGL3-Control 和pRL-SV40载体DNA共转染培养在标准6孔板中的CHO细胞 (2.5 ×10 5 细胞/孔) 。培养30小时后,将培养液吸干,每孔中的附着细胞用PBS洗涤一次。制备裂解液时加入500μl Passive Lysis Buffer到每一个培养板中,在室温温和地震荡15分钟。立即测试小组份的每一种裂解物中萤火虫和Renilla荧光素酶活力,然后分装,保存在 22℃(室温)、4℃,或-20℃。保存的样品在指示的时间间隔内重新测试。测试按图5所描述的方法进行,每一个方框代表3个重复的细胞裂解物,作2次重复测试的均值。

pRL-TK载体的环形图。附加描述:内含子的位置,Rluc ,编码Renilla荧光素酶的cDNA,Ampr, 在E.coli中编码氨苄抗性,ori, 在E.coli中质粒复制起始区。Rluc和Amp r基因中的箭头表示转录的方向。

小 结

在双遗传报告基因的应用中,一个报告基因活力的改变,与基因表达的特定实验条件相关,而第二个报告基因的组成性活力提供了内对照,使实验值可以规一化。 Promega的新的双报告基因测试系统,在单管中测试两个荧光素酶报告基因,此两个荧光素酶报告基因具有兼容的化学特性、操作条件、速度、灵敏度、线性范围、和仪器需要。荧火虫和海洋腔肠荧光素酶测试的组合,匹配pRL载体,提供了双遗传报告基因应用的理想测试系统。使用标准的手工荧光照度仪可在30秒内完成测试。特别设计的新的被动裂解液,可快速、高效地将培养在多孔板中的细胞裂解,并使萤火虫和海洋腔肠荧光素酶具有最适测试灵敏度和稳定性。双报告基因测试系统在体内报告基因应用的优势,也同样体现在无细胞系统的应用,比如体外转录/翻译反应。

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