萤火虫百科

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有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(三)

2012-09-09 20:10:20 本文行家:岛城小神仙

有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(三)双荧光素酶报告基因测试化学荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点,但它们在进化上的起源不同,因此,具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了DLR测试化学,选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个61kDa单亚基蛋白质,酶活力不需翻译后修饰(3,4),在翻译后即可作为遗传报告基因。在ATP,Mg2+和O2存在下

有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(三)有关萤火虫荧光素酶的基因序列和知识(三)

 双荧光素酶报告基因测试化学

  荧火虫和海洋腔肠荧光素酶都具有生物发光报告基因的卓越的测试特点 , 但它们在进化上的起源不同 , 因此 , 具有不同的酶学结构和底物要求。这些差别用来发展了 DLR 测试化学 , 选择性地区别这两种发光报告基因的活力。萤火虫荧光素酶是一个 61kDa 单亚基蛋白质 , 酶活力不需翻译后修饰 (3,4), 在翻译后即可作为遗传报告基因。在 ATP,Mg 2+ 和 O 2 存在下,通过甲虫荧光素的氧化反应发光 ( 图 1) 。在常规反应条件下 , 荧光素的氧化发生时 , 以荧光素 -AMP 作为中间体 , 转换非常缓慢。结果 , 在底物和酶混合后 , 测试化学产生"闪烁"的光 , 并迅速衰减。专利化的测试试剂 , 定量萤火虫荧光素酶活力 , 掺入了辅酶 A(CoA), 增强快速酶转换来提高反应动力学 (5), 导致持续的"闪烁"发光信号

由萤火虫和Renilla荧光素酶催化的生物发光

海洋腔肠荧光素酶,一个 36 kDa单亚基蛋白质,纯化自天然来源的 Renilla reniformis (6),含有3%的碳水化合物,但是和萤火虫荧光素酶一样,酶活力不需翻译后修饰,在翻译后即可作为遗传报告基因。海洋腔肠荧光素酶所催化的发光反应,利用O 2 和海样腔肠荧光素(coelenterazine) (图1)。当用DLR测试化学作实验时,海洋腔肠荧光素酶反应的动力学产生闪烁型发光信号,在检测过程中缓慢地衰减

在 DLR测试系统中,用单个裂解液分步测定萤火虫和海洋腔肠荧光素酶活力。在完成萤火虫荧光素酶活力("实验"报告基因)的测定后,萤火虫发光被快速湮灭,并同时激活海洋腔肠荧光素酶的发光反应("对照" 报告基因)。因此,DLR测试系统整合了两个测试化学,对共表达的两个报告基因作快速地定量,酶来自转染细胞裂解液,或无细胞转录/翻译反应。
    萤火虫荧光素酶测试的线性范围延伸达酶浓度的8个数量级,可测定≤1fg (大约10 -20 摩尔)的实验报告基因酶(图3A)。用双荧光素酶报告基因测试系统, 海洋腔肠荧光素酶的线性范围达酶浓度的7个数量级,较低的底限是≤ 10fg (大约3×10 -19 摩尔)的对照报告基因酶(图3B),并且这两个酶的特异活力相似。

用双荧光素酶报告基因测试由萤火虫和Renilla荧光素酶产生的发光。CHO细胞(1×10 6 /60mm培养板)共转染pGL3

Control和pRL SV40载体DNA。细胞用PBS洗涤后,加入400μl PLB制成裂解液。将20μl小量细胞裂解液和100μl荧光素酶测试试剂II(LARII)混合,萤火虫荧光素酶的活力立即用荧光照度仪检测(细线示踪)。100μl Stop &Glo TM 试剂加入到荧光照度仪管中,湮灭萤火虫荧光素酶反应,同时激活Renilla荧光素酶反应,并立即检测Renilla荧光素酶的活力(粗线示踪)。Turner Designs 型号20/20荧光照度仪配有计算机用来示踪荧光发射,12秒内完成两次测试。

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